1、 挑取第 2 代培養物中典型菌落，接種于麥芽浸膏營養肉湯培養基中，置 30℃±1℃ 恒溫培養箱中培養 42h～48h，即為第 3 代培養物。
2、 用 10.0mL 吸管吸取 5.0mL～10.0mL 第 3 代培養物，接種羅氏瓶，并搖動使菌液布滿 MEA 培養基表面，將多余肉湯培養物液體吸出，置 30℃±1℃恒溫培養箱中培養 42h～48h。
3、 向羅氏瓶培養物中加入 5.0mL～10.0mL 0.05%（V/V）吐溫 80 生理鹽水溶液，刮洗黑曲霉菌分生孢子于溶液中，將孢子懸液移入裝有玻璃珠的三角瓶中，輕輕振搖 1min ，過濾除去菌絲后，顯微鏡下（400 倍）觀察是否仍有菌絲存在，若有可經 5000 r/min～6000 r/min離心 20min。再次在顯微鏡下（400 倍）觀察，必要時重復上述步驟。
4、 黑曲霉菌分生孢子懸液冷藏保存不超過 2d，使用前，混合均勻，在顯微鏡下（400 倍）觀察是否有孢子出芽，若有則不得使用。
5、 將制成的菌懸液，進行活菌培養計數，按其結果用稀釋液稀釋至所需濃度，懸液定量殺滅試驗時，菌懸液濃度為1×107CFU/mL～5×107CFU/mL。
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