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光學(xué)顯微鏡經(jīng)過(guò)了我們偉大的前人們的努力與改良，已經(jīng)臻于完善的地步。事實(shí)上，通常的顯微鏡可以簡(jiǎn)單、快捷地為我們提供美麗的微觀圖像。但是，給這個(gè)近乎完善的顯微鏡世界帶來(lái)革命性創(chuàng)新的事件發(fā)生了，這就是“激光掃描型共聚焦顯微鏡”的發(fā)明。這種新型顯微鏡的特點(diǎn)是：采用僅將焦點(diǎn)所集中的面上的圖像情報(bào)提取出來(lái)的光學(xué)系統(tǒng)，通過(guò)改變焦點(diǎn)的同時(shí)將所獲得的信息在圖像存儲(chǔ)器內(nèi)復(fù)原，從而可以獲得具有3維信息情報(bào)的鮮明的圖像。通過(guò)這個(gè)方法，可以簡(jiǎn)單地獲得以通常的顯微鏡所無(wú)法確認(rèn)的、關(guān)于表面形狀的信息。另外，對(duì)于通常的光學(xué)顯微鏡來(lái)說(shuō)，“提高分辨率”與“加深焦點(diǎn)深度”是相互矛盾的條件，尤其在高倍率時(shí)這個(gè)矛盾更為突出，但在共聚焦顯微鏡來(lái)講，這個(gè)難題迎刃而解。

1.共聚焦光學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)

共聚焦光學(xué)系統(tǒng)是對(duì)樣品進(jìn)行點(diǎn)照明，同時(shí)反射光也采用點(diǎn)感受器來(lái)受光。樣品被放置在焦點(diǎn)位置時(shí)，反射光幾乎全部可以到達(dá)感光器，樣品偏離焦點(diǎn)時(shí)，反射光無(wú)法到達(dá)感光器。也就是說(shuō)，共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，只有與焦點(diǎn)重合的圖象會(huì)被輸出，光斑、無(wú)用的散亂光都被屏蔽掉了。

2.為何用激光？

共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，對(duì)樣品進(jìn)行點(diǎn)照明、同時(shí)反射光亦采用點(diǎn)感光器受光。因此，點(diǎn)光源就成為必要。激光屬于非常優(yōu)秀的點(diǎn)光源。大多數(shù)情況下，共聚焦顯微鏡的光源都采用激光光源。另外，激光所具有的單色性、方向性以及優(yōu)異的光束形狀等特征，也是被廣泛采用的重要理由。

3.高速掃描基礎(chǔ)上的實(shí)時(shí)觀察成為可能

激光的掃描，其水平方向采用了聲控光學(xué)偏向單元(Acoustic Optical Deflector，AO素子)、垂直方向采用了伺服電控光束掃描鏡(Servo Galvano-mirror)。音響光學(xué)偏向單元由于不存在機(jī)械性震動(dòng)部分，所以可以進(jìn)行高速的掃描， 在監(jiān)視畫(huà)面上實(shí)時(shí)觀察成為可能。這種攝像的高速性，是直接影響聚焦、位置檢索速度的非常重要的項(xiàng)目。

4.焦點(diǎn)位置和亮度的關(guān)系

共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，樣品被正確地放置在焦點(diǎn)位置時(shí)亮度為，在它的前后，其亮度皆會(huì)銳減(圖4實(shí)線)。這種焦點(diǎn)面的敏感的選擇性，也正是共聚焦顯微鏡高度方向測(cè)定以及焦點(diǎn)深度擴(kuò)張的原理所在。相對(duì)于此，通常的光學(xué)顯微鏡則在焦點(diǎn)位置前后不會(huì)有明顯的亮度變化(圖4點(diǎn)線)。

5.高對(duì)比度、高分辨率

通常的光學(xué)顯微鏡，由于偏離焦點(diǎn)部分的反射光會(huì)發(fā)生干擾，它與焦點(diǎn)成像部分發(fā)生重疊，從而造成圖像對(duì)比度的降低。而相對(duì)于此，共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，焦點(diǎn)以外的散亂光以及物鏡內(nèi)部的散亂光幾乎被去除掉，因而可以獲得對(duì)比度非常高的圖像。另外，由于光線2次通過(guò)物鏡使得點(diǎn)像更加先銳化，也提高了顯微鏡的分辨能力。

6.光學(xué)局部化功能

共聚焦光學(xué)系統(tǒng)中，與焦點(diǎn)重合點(diǎn)以外的部分的反射光被微孔屏蔽掉了。因此在觀察立體樣品時(shí)，形成如同用焦點(diǎn)面對(duì)樣品進(jìn)行切片后形成的圖象(圖5)。這種效果被稱為光學(xué)局部化，屬于共聚焦光學(xué)系統(tǒng)的特長(zhǎng)之一。

7.焦點(diǎn)移動(dòng)記憶機(jī)能

所謂焦點(diǎn)以外的反射光被微孔屏蔽掉，反過(guò)來(lái)看的話，可以認(rèn)為共聚焦光學(xué)系統(tǒng)所成的像上所有的點(diǎn)均與焦點(diǎn)重合。因此將立體樣品沿Z軸(光軸)方向移動(dòng)的話，將圖像累積保存在存儲(chǔ)器內(nèi)，最終就會(huì)獲得樣品全體與焦點(diǎn)重合而形成的圖像。以這種方法將焦點(diǎn)深度無(wú)限加深的機(jī)能稱做移動(dòng)記憶機(jī)能。

8.表面形狀測(cè)定機(jī)能

焦點(diǎn)移動(dòng)機(jī)能上，追加以面的高度記錄回路，就可以對(duì)樣品的表面形狀進(jìn)行非接觸式測(cè)定。以此機(jī)能為a基礎(chǔ)，對(duì)各畫(huà)素中輝度值形成的Z軸坐標(biāo)的記錄成為可能，并以此情報(bào)為依據(jù)可以獲得樣品表面形狀相關(guān)的情報(bào)。

9.高精度微小尺寸測(cè)定機(jī)能

受光單元采用了1維CCD成像傳感器，因此可以不受掃描裝置掃描傾斜等的影響，從而可以完成高精度的測(cè)定。另外，由于同時(shí)采用焦點(diǎn)深度可調(diào)(加深)的焦點(diǎn)移動(dòng)記憶機(jī)能，從而可以剔除由于焦點(diǎn)偏移而造成的測(cè)定誤差。

11.三維圖像解析

使用表面形狀測(cè)定機(jī)能，可以輕松地做出樣品表面三維圖像。不僅如此，還可以進(jìn)行多種解析如：表面粗糙度測(cè)定、面積、體積、表面積、圓形度、半徑、長(zhǎng)度、周長(zhǎng)、重心、斷層圖像、FFT變換、線幅測(cè)定等等。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量。