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摘要：戊二醛， 分子式為C5H8O2，帶有刺激性氣味的無色透明油狀液體，溶于熱水。用作殺菌劑，也用于皮革鞣制。對(duì)眼睛、皮膚和粘膜有強(qiáng)烈的刺激作用。

建立了一種測(cè)定血紅蛋白氧載體中戊二醛殘余含量的高效液相色譜方法。用10kDa超濾膜通過離心3000r/min×20min將游離戊二醛從待測(cè)樣品中分離；在pH1.0時(shí)，在含有70%乙腈的體系中用2，4*肼在30min內(nèi)將戊二醛衍生成2，4*腙（n（2，4*肼）∶n（戊二醛）=60∶1），以70%乙腈為流動(dòng)相，避免了衍生產(chǎn)物生成沉淀。用高效液相色譜法分離測(cè)定衍生物，可在20min內(nèi)完成分離，同時(shí)對(duì)衍生步驟進(jìn)行了優(yōu)化。本方法具有較高的靈敏度和良好的線性關(guān)系，檢出限為1.0ng，在0.1～10mg/L范圍內(nèi)其線性相關(guān)系數(shù)為0.9999，重復(fù)測(cè)定6次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%，回收率為95.26%。

「關(guān)鍵詞」戊二醛，高效液相色譜，血紅蛋白氧載體，2，4*肼1引言血紅蛋白氧載體（Hemoglobinbasedoxygencarriers，HBOCs）是血液替代品中熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一[1，2]。其常用的一種制備方法是以多醛基分子為交聯(lián)劑，如戊二醛，開環(huán)棉籽糖等將血紅蛋白交聯(lián)制備而成[3，4]。游離的戊二醛有一定的毒性，在臨床使用前必須除去。

檢測(cè)醛類氣相色譜[5～7]具有較高的分析速度，但是靈敏度相對(duì)較低[8]。高效液相色譜被廣泛應(yīng)用于醛的測(cè)定[9～11]，在測(cè)定戊二醛時(shí)，顯示出更高的靈敏度[8]。

在液相色譜法中，2，4*肼（2，4dinitrophenylhydrazine，DNPH）柱前衍生法是測(cè)定醛基的強(qiáng)有力的工具之一。文獻(xiàn)報(bào)道大多是測(cè)定空氣中戊二醛的污染，未見測(cè)定血紅蛋白氧載體中戊二醛的報(bào)道。《中國(guó)生物制品規(guī)程》中測(cè)定無細(xì)胞百日咳、白喉、破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗中戊二醛的方法[12]不能直接用于血紅蛋白氧載體中戊二醛的測(cè)定，需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)處理，且線性關(guān)系較差。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定血紅蛋白氧載體中殘留戊二醛的方法進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑高效液相色譜儀，包括控制器，檢測(cè)器，LC雙泵，脫氣系統(tǒng)，柱溫箱，工作站；恒溫水浴。離心機(jī)，超濾膜，恒流泵，超純水機(jī)。2，4*肼（98%）、HClO4、25%戊二醛（w/w）購(gòu)自Sigma公司，乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）。

2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取2.3760gDNPH，用20%HClO4溶解并定容至100mL，配制成濃度為120mmol/L的貯備液，用20%HClO4稀釋至30mmol/L作為工作液。

2.2.2無基質(zhì)血紅蛋白（Stromafreehemoglobin，SFH）的制備SFH的制備程序參見文獻(xiàn)[13]的方法。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線將戊二醛分別稀釋成0.1，0.5，1，2，4，6，8和10mg/L，分別取0.5mL于5mL離心管中，加入1.4mL乙腈，再加入0.1mL120mmol/LDNPH，立即于混旋器上混合均勻，反應(yīng)30min后，用有機(jī)濾膜過濾后，上樣20μL進(jìn)行分析。

2.2.4血紅蛋白的聚合過程中戊二醛的測(cè)定血紅蛋白的聚合參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行，取80g/LSFH50mL，用恒流泵逐滴加入適量的戊二醛（n（SFH）∶n（戊二醛）=1∶10），待滴加完畢，聚合反應(yīng)4h后，加入1.0mol/L（終濃度0.1mmol/L）進(jìn)行終止，1h后，加入還原劑二甲胺基（DMAB）進(jìn)行還原（n（戊二醛）∶n（DMAB）=1∶6），反應(yīng)1h后，用Ringer′s液作為透析液透析24h，每6h換液一次，共換液4次。4℃保存15d，各取5.0mL加入到2個(gè)超濾膜（10kDa，Millipore）中[15]，在4℃以3000r/min離心20min，取下層液體0.5mL，按2.2.3步驟進(jìn)行衍生并測(cè)定。

2.3色譜條件ShimpackVPODS色譜柱（250mm×4.6mmi.d.，5μm，孔徑12nm，日本Shimadzu公司）；流動(dòng)相：70%乙腈，流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm。

3結(jié)果與討論3.1目標(biāo)產(chǎn)物的確定戊二醛有2個(gè)醛基，與DNPH反應(yīng)后生成的DNPHone有3種可能的異構(gòu)體：順順、順反、反反異構(gòu)體。圖1為標(biāo)準(zhǔn)戊二醛衍生后的色譜圖。圖1在乙腈體系中衍生的2，4*腙的色譜圖Fig.1Chromatogramof2，4dinitrophenylhydrazine（DNPH）ones.Thephaseis70%acetonitrile峰（peak）1.過量的DNPH（ExcessDNPHreagent）；峰（peak）2，3.DNPHones異構(gòu)體（DNPHoneisomer）.有2個(gè)明顯的目標(biāo)峰（峰2與3），應(yīng)該為DNPHone的其中兩種異構(gòu)體，具體為哪一種異構(gòu)體還有待于進(jìn)一步鑒定，第3種異構(gòu)體沒有觀測(cè)到的原因可能是由于異構(gòu)體之間結(jié)構(gòu)非常相似，第3種異構(gòu)體保留時(shí)間和另外兩種異構(gòu)體的其中一種相同，也可能是第3種異構(gòu)體的含量特別少，很難觀測(cè)到。在一定范圍內(nèi)用不同濃度的反應(yīng)物進(jìn)行分析，該峰2和峰3的峰面積都和戊二醛濃度之間有良好的線性關(guān)系，都可用于定量研究。分析化學(xué)第37卷第10期嚴(yán)坤平等：高效液相色譜法測(cè)定血紅蛋白氧載體中殘留的戊二醛3.2色譜條件的優(yōu)化在酸性情況下，用過量的DNPH充分和醛基反應(yīng)，此反應(yīng)的產(chǎn)物2，4*腙在水中的溶解度較小，而在乙腈中的溶解度較大，圖2在50%乙腈體系中進(jìn)行衍生的2，4*腙樣品過濾前（a）后（b）色譜圖對(duì)比色譜條件和圖1相同（OtherconditionsarethesameasdescribedinFig.1）.峰（peak）1.過量的DNPH（ExcessDNPHreagent）；峰（peak）2，3.DNPHones異構(gòu)體（DNPHoneisomer）。直接在水中反應(yīng)或在乙腈比例較小時(shí)會(huì)使生成的產(chǎn)物產(chǎn)生沉淀。將6.0mg/L戊二醛在50%乙腈水溶液中衍生，產(chǎn)物用70%乙腈進(jìn)行分離，如圖2a所示，可以看出2，4*腙的色譜峰有明顯的拖尾，而將產(chǎn)物過濾后上樣（圖2b），則色譜峰無拖尾現(xiàn)象，這說明拖尾是由于沉淀在吸附在色譜柱上，隨流動(dòng)相中重新溶解后再被洗脫下來的緣故。而若將6.0mg/L戊二醛在70%乙腈水溶液中衍生，產(chǎn)物仍用70%乙腈進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物過濾和不過濾譜圖結(jié)果相同，都無拖尾現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，戊二醛濃度達(dá)到10.0mg/L時(shí)，在70%乙腈水溶液中衍生不會(huì)產(chǎn)生沉淀。本實(shí)驗(yàn)室采用文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定血紅蛋白氧載體中的戊二醛時(shí)，發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系較差，這就是由于采用的乙腈濃度太低，在衍生較高濃度的戊二醛（>6.0mg/L）時(shí)就會(huì)有沉淀產(chǎn)生，沉淀被過濾后導(dǎo)致定量分析不準(zhǔn)確。因此，衍生反應(yīng)應(yīng)該在乙腈比例較高的溶液中進(jìn)行，而且盡可能和流動(dòng)相比較接近，在70%乙腈溶液中進(jìn)行衍生可滿足10.0mg/L以下戊二醛的衍生。流動(dòng)相中乙腈的比例越大，衍生物洗脫時(shí)間就越短，峰形更為尖銳，相應(yīng)的靈敏度也越高，但是，洗脫時(shí)間太短，過量DNPH及雜質(zhì)的洗脫峰會(huì)干擾衍生物的洗脫峰，綜合考慮，以70%乙腈溶液為流動(dòng)相較好。

3.3衍生條件的優(yōu)化在優(yōu)化衍生條件的實(shí)驗(yàn)中，全部采用1.0mg/L戊二醛為分析物濃度，峰面積以的峰3計(jì)算。

3.3.1DNPH和戊二醛的摩爾比DNPH和戊二醛反應(yīng)生成希夫堿，該反應(yīng)不能進(jìn)行，因此通常采用過量的DNPH對(duì)戊二醛進(jìn)行衍生，盡可能將戊二醛定量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的腙。本實(shí)驗(yàn)在n（DNPH）∶n（戊二醛）為2∶1～120∶1的范圍內(nèi)研究了戊二醛的衍生反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，在70%乙腈，pH=1.0，在20℃反應(yīng)30min的條件下，隨著DNPH濃度的增大，衍生物的轉(zhuǎn)化率也逐漸增大，當(dāng)n（DNPH）∶n（戊二醛）≥60∶1時(shí)，轉(zhuǎn)化率基本保持不變，此條件可以作為定量分析的條件。本實(shí)驗(yàn)采用n（DNPH）∶n（戊二醛）=60∶1進(jìn)行衍生。

3.3.2pH值在乙腈中，HClO4比HCl的溶解性更好[16]，因此，本實(shí)驗(yàn)采用HClO4調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的酸度。為了操作和計(jì)算方便，近似認(rèn)為[H ]≈[HClO4]。本實(shí)驗(yàn)在上述條件下改變pH值，研究了pH值對(duì)衍生反應(yīng)的影響。如圖3所示，pH1.0時(shí)，戊二醛的衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

圖3pH對(duì)衍生效率的影響Fig.3EffectsofpHofmediumonconversionefficiencyofglutaraldehydetoitsDNPHonesn（DNPH）∶n（戊二醛，glutaraldehyde）=60∶13.2.3反應(yīng)溫度分別在0，10，20和30℃的條件下研究了溫度對(duì)衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果各溫度下衍生物的峰面積分別為166702，184363，187247，180590，除在0℃下面積略小外，其余溫度下的面積均非常接近，說明在10～30℃的范圍內(nèi)反應(yīng)基本不受溫度影響。因此，本實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。

3.2.4反應(yīng)時(shí)間在80min內(nèi)研究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率逐漸增大，在反應(yīng)20min后，衍生反應(yīng)達(dá)到平衡，衍生產(chǎn)物的濃度基本保持不變。為保證本方法的耐用性，衍生時(shí)間選擇30min。

3.3工作曲線、檢測(cè)限和精密度戊二醛濃度在0.1～10mg/L范圍內(nèi)與單峰面積呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=109306x-7405.1，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9999，而如果采用文獻(xiàn)[12]的方法，r<0.99。逐級(jí)稀釋樣品，進(jìn)樣20μL，當(dāng)信噪比為3時(shí)，戊二醛所對(duì)應(yīng)的濃度為0.05mg/L，即檢出限為1.0ng。以1.0mg/L戊二醛進(jìn)行衍生，平行6份，每份樣品各測(cè)定一次，每次進(jìn)樣20μL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.0%。

3.4標(biāo)準(zhǔn)加入的回收率采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定回收率。各取終產(chǎn)品5.0mL，分別加入到兩個(gè)10kDa的超濾膜中，在4℃以3000r/min離心10min，合并下層超濾液后取0.5mL，加入0.5μg（10μL0.05g/L）戊二醛，平行5份，按照2.2.3節(jié)進(jìn)行衍生。另取0.5mL超濾液按照2.2.3節(jié)直接進(jìn)行衍生，平行5份作為空白對(duì)照，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得平均回收率為95.3%。

戊二醛作為交聯(lián)劑直接加入終產(chǎn)品中再次會(huì)引起聚合反應(yīng)，所以上述測(cè)定回收率的方法是在超濾液中加入戊二醛進(jìn)行測(cè)定，為考慮超濾膜是否對(duì)戊二醛產(chǎn)生吸附，進(jìn)行了下述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，取0.10mg/L戊二醛，（1）同樣品處理方法進(jìn)行處理，然后進(jìn)行色譜分析；（2）直接進(jìn)行衍生后進(jìn)行色譜分析；兩個(gè)實(shí)驗(yàn)各平行10份，對(duì)兩者峰面積平均值在顯著性水平為0.05的情況下進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果兩者無顯著性差異，說明超濾膜對(duì)戊二醛基本無吸附，不會(huì)對(duì)回收率造成影響。

3.5終產(chǎn)品中戊二醛的測(cè)定戊二醛和血紅蛋白的胺基反應(yīng)后生成希夫堿結(jié)構(gòu)，希夫堿經(jīng)過還原后，生成穩(wěn)定的CN單鍵，但是，希夫堿是否能被99%還原還不清楚，如果沒有還原，由于生成希夫堿是可逆反應(yīng)，在一段時(shí)間后，沒有被還原的希夫堿會(huì)分解產(chǎn)生戊二醛，可以用本方法測(cè)定解離下來的戊二醛。本方法應(yīng)用于終產(chǎn)品中殘余戊二醛的測(cè)定，戊二醛濃度低于檢出限